Подготовка научных кадров по физико-химической биологии и биотехнологии - страница 8


^ Изучение механизмов дальнего транспорта белков и РНК геномов по растению

Группа Молекулярная диагностика


С помощью метода дрожжевой двугибридной системы были найдены некоторые ядерные белки-партнеры 4/1 белка. Среди них нуклеопорин NUP155 и компонент экзосомного комплекса RRP43, а также транскрипционные факторы растений. Выявлены взаимодействия с: 1) представителем семейства транскрипционных факторов типа C(2)H(2), несущим структуру цинкового пальца; 2) фактором ATAF2; 3) этилен-чувствительным фактором ERF03 (EREBP) и 4) гомеодоменным фактором BLH1. Все обнаруженные транскрипционные факторы, способные взаимодействовать с белком 4/1, участвуют в ответе на условия биотического или абиотического стресса, что указывает на возможное участие белка 4/1 в развитии ответной реакции на стрессовые условия. BLH факторы способны образовывать ряд гетерологичных белок-белковых комплексов с другими гомеодоменными транскрипционными факторами (например, STM). Ряд таких факторов обладают способностью перемещаться от клетки к клетке подобно белку 4/1, но не транспортируются в ядро в отсутствие BLH. Так как BLH1 способен связывать 4/1 белок, то можно предположить, что между ними существует функциональное взаимодействие. Растительный аналог белка животных и человека BAP31, играющего важнейшую роль в сортировке интегральных мембранных белков из Nicotiana benthamiana, также является белком-партнером Nt-4/1 белка. Причем сила и репрезентативность их взаимодействия в дрожжевой двугибридной системе намного превосходит других партнеров Nt-4/1.

Была изучена субклеточная локализация белка 4/1 и его мутанта NDR при ко-экспрессии с вироидной РНК. Мутант NDR локализовался во флоэме вне зависимости от присутствия вироида. Ко-экспрессия с вироидом стимулировала локализацию белка 4/1 дикого типа во флоэме. При низкой концентрации агробактерий (менее 0,3 ОЕ) флоэмная локализация наблюдалась лишь иногда, флоэмная локализация белка дикого типа сильно зависит от условий выращивания растений (длина светового дня) перед агроинокуляцией. Выращивание при длине светового дня равной 4 часа, 4/1 белок локализуется во флоэме даже в отсутствие вироида. Ко-экспрессия 4/1 с вирусным супрессором сайленсинга, способным связывать двуспиральные РНК, подавляет появление белка во флоэме. Белок дикого типа также проявляет динамическую локализацию в листе и способен накапливаться в минорных жилках листа. Этот тип локализации стимулируется коротким световым днем при выращивании растений и ко-экспрессией с вироидом. Однако, ко-экспрессия с ингибитором сайленсинга р19 блокирует флоэмную локализацию 4/1.

Обнаружена способность белка Nt-4/1 связывать двухцепочечную РНК вироида клубней картофеля (potato spindle tuber viroid, PSTVd) (неопубликованные данные). Что позволяет предположить, что 4/1 белок принимает участие в переносе различных видов двухцепочечных РНК, и, таким образом, вовлечен в процессы роста, развития и/или ответа растений на вирусные инфекции. Согласно этому предположению растительный белок 4/1 может участвовать в одном из путей процесса «умолкания генов» у растений.


^ Поиск пептидных маркеров рака яичника в сыворотке крови человека при помощи протеомных технологий.

Лаборатория протеомики


Тандемной масс-спектрометрией, сопряженной с обращено-фазной ВЭЖХ, в образцах сыворотки крови практически здоровых доноров (42), пациенток с раком яичников (17), больных с колоректальным раком (14) и сифилисом (12) было идентифицировано 1935, 724, 527 и 620 пептидов, соответственно. Всего было идентифицировано 2732 неповторяющихся пептида, являющихся фрагментами1778белков.

В результате коррекции построенной на предыдущем этапе исследований математической модели, предназначенной для классификации масс-спектрометрических профилей сыворотки крови, были получены значительно более высокие значения ее специфичности по отношению к таким доброкачественным гинекологическим заболеваниям, как аденомиоз (100%), миома матки (100%), гиперплазия эндометрия (72,7%), доброкачественные новообразования яичников (100%), кистозный эндометриоз яичников (88,9%). Специфичность ранее построенной модели по отношению ко всем перечисленным заболеваниям женской репродуктивной системы была хуже 50%.


^ Протеомный анализ мха Physcomitrella patens

Лаборатория протеомики


Для исследования протеома протопластов использовали 1D электрофорез в денатурирующих условиях с последующим анализом триптических пептидов методом условиях с последующим анализом триптических пептидов методом nano_LC-ESI-MS/MS. Данный подход позволил выявить 408 белков. Кроме того, для анализа изменений протеома протонемы при получении протопластов использовали двумерный электрофорез с дифференцирующим окрашиванием. Было установлено, что происходит распад ряда белков (преимущественно хлоропластных).

Проведено исследование пептидома протопластов, полученных из протонемы мха. Для анализа брали протопласты и точки регенерации 24, 48 и 72 часа. Полученные результаты проанализированы с помощью нескольких поисковых машин, идентифицированы пептидогенные белки. Установлено, что в процессе выделения протопластов происходит деградация многих клеточных белков и в первую очередь белков фотосинтетического аппарата. Изучение пептидома протопластов в процессе регенерации показало, что происходит снижение общего количества пептидов в клетках, восстанавливается фотосинтетическая активность.


^ Изучение биологически активных пептидов – ингибиторов ревертазы ВИЧ-I из морских беспозвоночных (морские черви)

Лаборатория биотехнологии


Продолжена работа с пептидами из червя №75. После уже описанных в отчёте за 2010г. двух стадий выделения пептидов из червя №75 (см. «Схему делений»), полученные вещества были поделены на колонке С-18 ВЭЖХ (дел.I и II). Деление каждой из загрузок проводили дважды, чтобы иметь возможность сделать запись для фракций, выходящих с колонки, отдельно при 220нм, а в следующем делении - при 280нм. В каждом делении отобраны фракции, элюируемые при одинаковом времени выхода (τ в мин.) и обладающие биологической активностью (БА) - ингибиторной способностью к обратной транскриптазе или ревертазе (RТ-аза). Таким образом после деления I собрали три группы фракций: начальные (τ от 6 до 15мин.), срединные (τ от 20 до 30мин.) и конечные (τ 32-34мин.).

Затем подобным образом были поделены фракции в делении II. Здесь были собраны проявившие БА по RТ-азе фракции: начальные (τ 6-8мин.), срединные (23-30 мин.) и конечные (34.3 мин.).

В результате, в делении I в составе начальных фракций отфиксировано вещество – τ 6- 6.3 мин., m 698, дающее полное ингибирование RТ-азы. Из срединных фракций в делении 2 пики с τ 25-27 мин. и τ 27-30 мин. показали 85% остаточную активность. Деление 3 дало лучшие результаты – фракции с τ 24-26 мин. обладали 32%-ной остаточной активностью. В делении 7 срединные фракции (18-21 и 21-24 мин.) показали 50% ингибирование.

Более активными оказались фракции из деления II (см. cхему) на колонке ВЭЖХ С-18. Здесь даже начальные фракции (в делениях 5 и 10, 6 и 11) проявили хорошую активность, например, остаточная БА для фр. 3 дел. 5 (τ 8 мин.) была 33%, фр. 2 дел.10 (τ 6 мин.) – менее 10%, фр. 2 и 3 дел.6 (τ 7 мин.) – 27%.

И срединные фракции из этих делений были наилучшими: дел. 5 фр. 7 дала ингибирование до 40% (и отфиксирована масса 1107Да). Фр.4 из дел.10 (пик 23,7 мин.) показала полное ингибирование. В УФ-спектре этой фракции отмечен максимум 273нм (возможно наличие ароматических аминокислот). Соответственно, в следующей паре делений (дел.6 и11), загрузкой которых были более поздние фракции с колонки Р-60, отмечены: фракция 7 (τ 22-23 мин.) - ингибирование до 70%, следующий пик дел.8 (τ 23-27 мин.) – ингибирование до 50%. Среди дальних фракций отмечен во всех делениях пик с τ 34,4 мин., содержащий ароматику и дающий ингибирование до 40% остаточной активности. Выделенные БА вещества изучаются.

Продолжена работа с пептидами из червя № 81 (Курильский вид). Изучены фракции после колонки ПХР и деления на Р-60 (4). Получены фракции 12- 13 (фр. 3) и фракции 15- 17 (фр. 4) из области низкомолекулярных веществ (~ m 1КДа) с очень хорошей БА: для фракции 3, БА упала до 37%, а 2 мкл фракции 4 (ОП280 0,12о.ед.) вызвали падение до 16% остаточной активности ревертазы. УФ-спектр этой фракции показал возможное присутствие фенилаланина.


^ Функциональное влияние ионов магния на физиологическую активность

Cа2+-связывающих белков в сигнальных системах клетки.

Лаборатория химии белка ФИБХ


Продолжено изучение влияния ионов магния на структурные свойства рековерина дикого типа и его мутантные формы с выключенными кальций связывающими центрами. Методом люминесцентной спектроскопии проведено исследование эффективного сродства рековерина к катионам кальция, в зависимости от концентрации свободного магния. Также исследовано эффективное сродство рековерина к катионам магния, в зависимости от концентрации ионов кальция. Проведён анализ зависимости термостабильности рековерина от концентрации кальция и магния в растворе. Совокупность полученных данных указывает на наличие в рековерине магний-специфичного центра, отличного от сильных кальций связывающих центров белка.


^ Исследование особенностей регуляции ангиогенеза

Лаборатория химии белка ФИБХ


Самоформирующиеся пептиды способны образовывать из мономеров сложные упорядоченные олигомерные структуры, имеющие потенциал использования в технике и медицине. Так, филаменты, образуемые пептидом NH2-(RADA)4-COOH могут найти применение в качестве среды для пролиферации клеток в тканевой инженерии, в частности, при лечении сердечно-сосудистых заболеваний, связанных с ишемией.

Процесс образования филаментов из NH2-(RADA)4-COOH был исследован in silico моделированием молекулярной динамики в Amber11 в явном водном окружении и силовом поле ff03 пептидных мономеров, димеров, тетрамеров, октамеров и додекамеров с использованием докинга в HEX6.1 в режиме учета геометрии модели и поверхностных зарядов, а также GRAMM-X.

Анализ энергии образования комплексов ΔG, ΔµGBSA, EMM демонстрирует тенденцию к образованию олигомерных структур. Данные по RMSd и RMSf, а также карты Рамачандрана доказывают уверенную стабилизацию структур, начиная с тетрамера.

Показано, что ядром образования филамента можно считать тетрамер, в котором β-антипараллельные структуры димеров стабилизируются гидрофобными взаимодействиями остатков Ala между димерами, а сам филамент представляет собой двухслойную структуру, где внутри каждого слоя присутствуют β-антипараллельные структуры, а слои связаны между собой гидрофобными взаимодействиями.


^ Изучение структуры и субстратной специфичности ферментов высокоактивного бактериолитического комплекса, продуцируемого бактерией Lysobacter sp. XL1.

Лаборатория химии белка ФИБХ


Фундаментальной задачей, на решение которой направлен данный проект, является исследование первичной структуры и субстратной специфичности бактериолитических ферментов, продуцируемых бактерией Lysobacter sp. XL1. Ранее были выделены 5 бактериолитических ферментов, один из которых оказался, как ранее было показано, гомологом альфа-литической эндопептидазы бактерии Lysobacter enzymogenes, а 4 других оказались новыми неизвестными ранее белками, по N-концевым аминокислотным последовательностям (от 15 до 20 аминокислотных остатков) не имеющим гомологии с аминокислотными последовательностями, представленными в международных банках белковых структур. N-концевые последовательности этих белков зарегистрироваы нами в международной базе белковых структур UniProt (UniProtKB/Swiss-Prot accession numbers: L1 – P85142, L2 – P85143, L3 – P85152, L4 – P85155, L5 – P85158). Ферменты обладают различной специфичностью и способны гидролизовать пептидогликаны клеточных стенок различных типов бактерий. Изучение бактериолитических ферментов представляет особый интерес также в связи с их способностью расщеплять пептидные связи, образованные D-аминокислотами, являющихся компонентами пептидогликана клеточных стенок бактерий. В результате работы получены следующие результаты:

1. Методами белковой химии проведен анализ первичной структуры одного из труднодоступных бактериолитических ферментов, фермента L2 (~ 25 kDa), секретируемого бактерией Lysobacter sp. XL1 в минорных количествах, однако, вносящего свой вклад в расширение спектра атимикробной активности бактериолитического комплекса. Ранее было показано, что фермент L2 является амидазой, расщепляющей в пептидогликане связь между N-ацетилмурамовой кислотой и L-аланином.Для выделения бактериолитического фермента L2 был получен малоактивный штамм Lysobacter sp. XL2, не секретирующий фермент L1 , но секретирующий повышенное количество фермента L2 по сравнению со штаммом XL1., и разработана схема выделения белка. В результате был получен электрофоретически гомогенный препарат в количестве около 0.5 мг, что дало возможность приступить к изучению его первичной структуры. Осуществлен гидролиз белка трипсином, полученная смесь фрагментов разделена методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, установлена структура 15 триптических пептидов, в сумме составляющих около 165 аминокислотных остатков, это дает возможность синтезировать зонды для выделения кодирующей этот белок ДНК и приступить к определению его структуры, что является целью дальнейшей работы.

2. Совместно с одной из лабораторий ИБФМ им.Г.К.Скрябина РАН определена первичная структура внеклеточного бактериолитического фермента L5, продуцируемого бактерией Lysobacter sp. XL1. Полученные нами данные об аминокислотной последовательности N-концевого и внутренних участков молекулы бактериолитической эндопептидазы L1 позволили определить нуклеотидную последовательность фрагмента ДНК Lysobacter sp. XL1 размером около 8 т.п.н., в составе которого идентифицированы две ОРС. Одна, размером 1197 п.н., кодирует эндопептидазу L1, вторая ОРС, размером 1200 п.н. кодирует гомологичную ей (степень гомологии 59%) последовательность, которая по N-концевой последовательности, определенной нами ранее, соответствует полипептидной цепи бактериолитической эндопептидазы L5.

3. Проведено частично изучение субстратной специфичности бактериолитического фермента L5. При этом установлено, что фермент L5 активно разрушает клеточные стенки ряда нативных и автоклавированных микроорганизмов. Показано, что фермент L5 является эндопептидазой, и не проявляет мурамидазную активность. Особенно интересным результатом является то, что фермент L5 обладает способностью разрушать клеточные стенки нативных клеток грамотрицательных бактерий.


^ Синтез пептидов - агонистов неопиоидного рецептора бета-эндорфина и изучение их активности при различных стрессорных воздействиях

Лаборатория пептидных биорегуляторов ФИБХ


Синтезированы октарфин TPLVTLFK, его циклические мономер и димер и исследована их активность на моделях острой геморрагии и гипобарической гипоксии у крыс in vivo. Установлено, что все три пептида в дозе 1 мкг/кг корригируют, а в дозе 10 мкг/кг нормализуют содержание кортикостерона и катехоламинов в надпочечниках и плазме крови крыс, подвергнутых геморрагическому шоку. Стресс-протекторное действие октарфина и циклопептидов было зафиксировано также у крыс, подвергнутых гипоксии: интраназальное введение пептидов в дозах 0,1 и 1 мкг/кг за 1 и 24 часа до “подъёма” нормализовало содержание кортикостерона и адреналина в надпочечниках и крови. Аналогичный результат был получен на моделях холодового и теплового шока у крыс in vivo: троекратное интраназальное введение крысам октарфина или его циклических мономера и димера в дозах 10-20 мкг/животное за трое, двое и одни сутки до шока предотвращало резкое возрастание секреции кортикостерона и катехоламинов из надпочечников в кровь, а также устраняло изменения содержания свободного гистамина и активности диаминоксидазы в миокарде. Во всех изученных случаях циклодимер октарфина был наиболее активен. На основании полученных результатов сделано заключение о целесообразности дальнейшего исследования октарфина и его циклического димера в качестве потенциальных стресс-протекторов.


^ Изучение продуктов побочных реакций в синтезе биологически активного пептида – гормона трипторелина с целью оптимизировать его синтез и последующую очистку

Группа инструментальных методов синтеза ФИБХ


В ходе выполнения работы была исследована возможность устранения побочных продуктов в синтезе гормона трипторелина pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2, с целью повысить его выход. Синтез проводился с использованием Вос-стратегии на твердой фазе (смоле Меррифильда) с последующим отщеплением пептида аммиаком. Были отработаны несколько схем синтеза. В первой использовались аминокислоты без защит боковых функциональных групп. Выяснилось, что этот способ дает самый низкий выход продукта, менее 5%, так как сопровождается большим количеством побочных реакций. Другой метод синтеза – использование только защищенных по боковым функциям триптофана (Trp(For)) и гистидина (His(Tos)), что дало возможность повысить конечный выход пептида, вероятно, за счет исключения алкилирования триптофана и эпимеризации гистидина.

Однако, использование незащищённого по боковой цепи серина приводит к накоплению продуктов олигомеризации серина, его О-ацилированных форм и продуктов разложения этих соединений. По данным ВЭЖХ\МС в продукте присутствовала примесь продукта включения лишнего остатка серина в количестве до 9%. Это согласуется с литературными данными о том, что в ходе кондененсации с активированнными эфирами незащищённого по боковой цепи серина протекает процесс О-ацилирования. Затем при раскислении проходит миграция O,N-миграция серина, приводящая в нашем случае к получению H-JHWSSYwLRPG-NH2. С помощью ВЭЖХ\МС был найден ряд побочных продуктов возникающих в условиях аммонолиза. Например, продукт вероятной замены ОН-группы серина на амино-группу, образующийся путём элиминирования с модифицированного серина ацил-анион по типу реакции ретро-Михаэля, а затем присоединения аммиака по двойной связи.

Для подавления побочной реакции ацилирования серина была сделана попытка использовать его защищённое по боковой цепи производное, N-,O-полуаминаль метаналя (ΨH,HPro). Таким методом была исключена димеризация серина. Однако, удаление метиленового мостика в условиях снятия Boc-защиты приводило к O-ацилированию серина и последующим осложнениям. И, наконец, был использован метод временного силилирования гидрокси-групп серина и тирозина перед проведением реакции конденсации. Применение этой схемы позволило исключить О-ацилирование тирозина, но не серина. Количество и физико-химические свойства возникающих примесей не позволяют проводить эффективную очистку продукта ни в одном из найденых нами хроматографических способов выделения [D-Trp6] LH-RH. Вариант разделения с помощью ВЭЖХ на обращённофазном сорбентее С18 приводил к выделению около 5% продукта. В качестве альтернативного хроматографического метода разделения была выбрана распределительная хроматография на силикагеле. Используя стандартные смеси растворителей для данного метода разделения (галогеналканы-спирты-вода-кабоновые кислоты) нами были найдены условия в которых удавалось выделять целевой продукт в количестве до 35 % от теоретически возможного. Усовершенствование метода анализа трипторелина (подбор колонки, градиента) позволило обнаружить разницу в степени чистоты образцов полученных после деления на обращённой фазе и на силикагеле. Первые содержали до 15 % примесей, вторые оказались более загрязнёнными. Основную проблему очистки создавали продукты побочных реакций по незащищённому серину, которые имеют незначительное отличие во временах удерживания относительно трипторелина.


^ Оптимизация синтеза новых и известных реагентов для пептидного синтеза. Методологические проблемы синтеза пептидов

Лаборатория химии пептидов ФИБХ


Синтезированы 4 новых гетеробифункциональных реагента на основе моно-N-гидроксисукцинимидного эфира глутаровой кислоты, вторую карбоксильную группу которой превращали в сложный тиоэфир. В качестве тиольной компоненты использовались различные N-ацилпроизводные цистеамина и 4,6 диметилпиримидинтиол-2, не обладающие ярко выраженным запахом, свойственным более летучим меркаптанам. Однако более существенными преимуществами синтезированных конструкций следует считать возможность а) тонко подстраивать электрофильность тиоэфирной функции посредством варьирования электронных свойств N-ацильного заместителя в производных первого типа и б) манипулировать реакционной способностью производных пиримидинтиола путём изменения рН реакционной среды. Работоспособность новых реагентов продемонстрирована в реакциях коньюгации методом нативной химической сшивки (NCL) на модельных парах: первичный амин/пептид с N-концевым цистеином.


^ Исследование механизма взаимодействия кальций связывающего белка акворина с его функциональным партнером – зеленым флуоресцентным белком (GFP).

Группа биоинженерии репортерных белков ФИБХ


Получен ряд генно-инженерных конструкций, кодирующих гибридный белок eGFPAeq, содержащие мутации в донорном модуле(акворине). Исследование физико-химических свойств полученных мутантных белков позволили локализовать аминокислотные остатки, ответственные за Са-индуцированное взаимодействие донорного модуля с eGFP, расположенные ( по данным рентгеноструктурного анализа) в псевдо петле акворина, контактирующей с первой Са петлей. Биолюминсцентный анализ переноса энергии мутантных белков позволил конкретизировать аминокислотные остатки в D – спиральной структуре акворина, участвующих в взаимодействии с eGFP в составе гибридного белка.

Эти результаты в совокупности с результатами по мутагенезу eGFP, позволяют предположить, что высокоэффектвный перенос энергии биолюминесценции в гибридном белке eGFPAeq осуществляется посредством “слабых” взаимодействий боковых радикалов аминокислот S147,S202, Y151, направленных наружу в модуле eGFP с боковыми радикалами аминокислот W79,K87, K88 и Т91 в модуле акворина. (нумерация аминокислот дана по индивидуальным модулям).Эти взаимодействия ограничивают свободу перемещений донора и акцептора в составе гибридного белка. В результате таких ограничений хромофор eGFP (акцептор) и хромофор целентаразина в акворине (донор) находятся в одной плоскости, что является оптимальным условием переноса энергии по теории Ферста. Блокирование перечисленных аминокислотных остатков посредством белков ингибирует перенос энергии биолюминесценции.

В рамках совместной работы с институтом биохимии им.Баха для изучения индуктивно-резонансного переноса энергии, получены генетически-кодируемые FRET-пары на основе тербий-связывающего пептида и красных флуоресцентных белков DsRed2 и TagRFP. Получены два новых каспазных FRET-сенсора на основе тербий-связывающего пептида и красных флуоресцентных белков DsRed2 и TagRFP. Методом люминесцентного анализа подтвержден перенос энергии внутри обоих сенсоров. Эффективность переноса энергии внутри отTb3+- к акцепторным белкам составляет 28% и 35% для DsRed2 и TagRFP гибридных белков.


0481326347436962.html
0481359847101515.html
0481446826486617.html
0481551956704607.html
0481703087406647.html